北理工課題組在工業(yè)微生物新型堿基編輯技術(shù)方面取得重要進(jìn)展
發(fā)布日期：2023-06-08 供稿：生命學(xué)院 攝影：生命學(xué)院
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近日，北京理工大學(xué)郭淑元教授與霍毅欣教授團(tuán)隊(duì)合作在枯草芽胞桿菌堿基編輯器研究方面取得重要進(jìn)展。相關(guān)研究成果以“The construction of a PAM-less base editing toolbox in Bacillus subtilis and its application in metabolic engineering”為題，在頂級(jí)期刊《Chemical Engineering Journal》（影響因子：16.744）上發(fā)表（doi.org/10.1016/j.cej.2023.143865）。該工作以北京理工大學(xué)為第一通訊單位，郭淑元教授和霍毅欣教授為共同通訊作者，博士研究生夏燕和孫麗超副研究員為共同第一作者。
CRISPR/Cas9介導(dǎo)的堿基編輯器已經(jīng)成為了一種強(qiáng)大的基因組編輯工具，并廣泛應(yīng)用于代謝工程等領(lǐng)域。堿基編輯器可以提前引入終止密碼子，產(chǎn)生點(diǎn)突變，調(diào)節(jié)基因表達(dá)水平，改造蛋白質(zhì)序列以及構(gòu)建底盤突變庫等。然而，堿基編輯器對特定PAM的識(shí)別需求限制了其作用范圍和編輯靈活性。為此，團(tuán)隊(duì)首次在枯草芽胞桿菌中建立了無PAM限制的（PAM-less）的PLABE、PLCBE以及PLACBE堿基編輯工具箱，成功實(shí)現(xiàn)了基因組上任意A/C位點(diǎn)的編輯。同時(shí)，建立了PAM-less多靶點(diǎn)堿基編輯技術(shù)，并將其應(yīng)用于代謝工程改造，通過一次構(gòu)建產(chǎn)生16種突變菌株的組合，成功將化學(xué)品乙偶姻的產(chǎn)量提高了26.3 %（圖一）。
論文對Cas9突變體SpRY的識(shí)別范圍進(jìn)行了系統(tǒng)掃描，發(fā)現(xiàn)不同物種中SpRY的PAM位點(diǎn)具有不同的偏好性。通過建立無偏差的PAM位點(diǎn)識(shí)別評估系統(tǒng)，確定了枯草芽胞桿菌中SpRY最偏好的位點(diǎn)為NGG、NGA、NAT和NAC，最不偏好的位點(diǎn)為NCC、NCT、NTC和NTA。利用枯草芽胞桿菌中SpRY的PAM識(shí)別特異性信息，我們可以在基因組編輯過程中挑選出高活性的PAM位點(diǎn)，同時(shí)避免使用效率低下的位點(diǎn)（圖二）。
PAM-less堿基編輯器可以實(shí)現(xiàn)對任意氨基酸的突變，能夠?qū)蚪M98.8%的基因提前引入終止密碼子，且超過50%的基因均可找到10個(gè)以上的編輯位點(diǎn)。考慮到SpRY介導(dǎo)的堿基編輯器提供了大量可編輯的位點(diǎn)，在全基因組水平預(yù)測和選擇高效編輯位點(diǎn)將是一項(xiàng)耗時(shí)的工作。為此，我們開發(fā)了一個(gè)在線網(wǎng)站（https://bitguolab-bsbe-main-wphd8g.streamlit.app/），用于快速檢索和生成SpRY介導(dǎo)的堿基編輯器靶向序列，該網(wǎng)站將大幅推動(dòng)基因失活操作中的gRNA高通量設(shè)計(jì)（圖三）。
此項(xiàng)工作結(jié)合了郭淑元教授在芽胞桿菌中的研究基礎(chǔ)和霍毅欣教授團(tuán)隊(duì)在基因編輯技術(shù)方面的長期積累。近兩年，雙方已經(jīng)合作發(fā)表了一系列高水平論文，包括枯草芽胞桿菌密碼子拓展底盤的建立（ ACS Synthetic Biology , 2023, 12(2):583-595）、枯草芽胞桿菌長片段敲除系統(tǒng)的建立及基因組敲除庫的構(gòu)建（ International Journal of Molecular Sciences , 2022, 23(9):48-53），以及堿基編輯領(lǐng)域研究進(jìn)展的綜述（ Biology , 2022, 11, 571）、食品添加劑香蘭素的生物合成策略綜述 （ Microbial Cell Factories , 2023, In revision）。
該項(xiàng)工作得到了國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國家自然科學(xué)基金以及北京市自然科學(xué)基金的支持。
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